Главная > Болезни > Жидкая обогащенная питательная среда для прямого посева крови 100мл

Жидкая обогащенная питательная среда для прямого посева крови 100мл

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Лактобактерии (Lactobacillus spp.) принадлежат к группе неспорообразующих грамположительных палочек. Они являются представителями резидентной микрофлоры человека, в первую очередь полости рта, кишечника и влагалища. Изменение количественного и качественного состава лактобактерий является диагностическим признаком дисбактериоза. В редких случаях лактобактерий могут явиться возбудителями инфекционной патологии, чаще у новорожденных: сепсис, эндокардит, менингит, пневмония и некоторые другие. Большое значение эти микроорганизмы имеют для пищевой промышленности, поскольку занимают ключевую позицию в производстве молочнокислых продуктов (простокваша, кефир, йогурт, ацидофилин). Таким образом, перед микробиологами стоят непростые задачи выделения, идентификации, культивирования и хранения Lactobacillus spp. Микроорганизм полиморфен (палочки, коккобациллы), разнообразен по типу дыхания (факультативный анаэроб, микроаэрофил, облигатный анаэроб). Он обладает немногочисленными культуральными признаками, позволяющими отличать его от морфологически сходных бактерий (образование молочной кислоты, отсутствие каталазы, устойчивость к ванкомицину и некоторые другие.). Важное место в выделении лактобактерий занимают питательные среды, обеспечивающие рост и , в определенной степени, селекцию этих микроорганизмов. В мировой микробиологической практике их насчитывают несколько десятков. Наибольшее признание получила среда de Man, Rogosa, Sharpe, которую по первым буквам фамилий авторов обычно обозначают как среда MRS (MPC в русской транскрипции). Существует ряд модификаций этой среды, улучшающих, по мнению разработчиков, их ростовые свойства и селективность. В России получила распространение среда МРС-4, которая заметно отличается от авторской по своей рецептуре, но признана достаточно эффективной. Среда МРС-2 (полужидкая) является одной из лучших при работе с чистой культурой и для хранения культур. Лактобациллы дают в столбике среды типичный рост.

Среда МРС авторская плотная. Среда de Man , Rogosa , Sharpe ( MRS ) плотная для культивирования молочнокислых бактерий.

Среда МРС авторская жидкая. Среда de Man , Rogosa , Sharpe ( MRS ) плотная для культивирования молочнокислых бактерий.

Среда МРС модифицированная плотная. Включен Твин 80, рН 6,2. Для выделения и культивирования Lacto — bacillus spp .

Среда МРС модифицированная жидкая . Включен Твин 80, рН 6,2. Для выделения и культивирования Lacto — bacillus spp .

Среда МРС жидкая ( вариант LHSB ), рН 4,3. Для выделения лактобактерий из продуктов питания.

Среда МРС плотная ( вариант LHSB ), рН 5,5. Для выделения лактобактерий из продуктов питания.

По материалам www.nicf.spb.ru

«Двойная среда», состоящая из скошенного во флаконе 150 мл 1,7%-2% питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь засевают в жидкую часть среды. Инкубируют в термостате при 37 град. С. Флаконы ежедневно просматривают, при этом, наклоняя флакон, смачивают поверхность скошенного агара бульоном. Это исключает необходимость высева на плотные питательные среды и, следовательно, уменьшает риск загрязнения при пересевах.

«Среда для контроля стерильности». Эту среду следует обогатить, добавив дрожжевой экстракт до 20 г на 1 литр (не менее 15 г) и агар до 5 г на 1 литр (не менее 4,25 г). Добавляют к среде 0,001 г резазурина — индикатора кислорода. Анаэробные условия контролируют по розовому окрашиванию среды. При покраснении более 20% столбика среды можно ее регенерировать на водяной бане в течение 20 минут при 100 град. С. Однако, эту операцию можно производить только один раз. Среда дает возможность получить рост некоторых анаэробных и полуанаэробных микроорганизмов.

«Среда со стаканчиком». — для предварительного лизиса форменных элементов крови. Для приготовления этой среды во флаконы с широким горлом (диаметром 30 мм), емкостью 250 мл наливают 50 мл дистиллированной воды, содержащей 0,1% агара. В этот флакон пинцетом опускают стеклянный стаканчик или пробирку длиной 70 мм и диаметром 20-22 мм, в которой находится 12 мл концентрированной питательной среды: (состав: на 100 мл перевара Хоттингера с остаточным азотом 750-800 мг%, 2 г глюкозы, 2 г хлористого натрия, рН 7,5-7,4). Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм.

Для получения гемокультуры в «среде со стаканчиком» в агаризованную воду помещают 3-5 мл крови. Оставляют флакон при комнатной температуре на 30-40 минут для гемолиза форменных элементов крови. Затем, наклоняя флакон, выливают содержимое стаканчика в водный раствор с кровью, флакон ставят в термостат. Посев гемолизированной крови позволяет выявить бактериемию в ряде случаев, тогда, когда на других средах роста нет. Высвобождение микроорганизмов, адсорбированных на эритроцитах или подвергшихся незавершенному фагоцитозу, а также снижение антибактериальной активности гемолизированной крови, делает эту среду особенно ценной при заболевании, для которого характерна незавершенность фагоцитарной реакции.

Полужидкая среда Тароцци с 0,5% глюкозы и 0,1% агара во флаконах по 300 или 150 мл. Во флаконы сеют 5 мл и 3 мл крови (соответственно количеству среды), (см. раздел 3.2.).

Жидкая среда Сабуро служит для выявления грибковых септических состояний.

Приготовление: на 1 литр дистиллированной воды берут 10 г пептона, 25 г хлористого натрия, 40 г глюкозы. Разливают во флаконы по 150-200 мл, стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут (рН 5,5). В жидкую среду Сабуро засевают 3-4 мл крови.

Культивирование. Засеянные кровью среды инкубируют в течение 6 недель в термостате при 37 град. С. Просматривают ежедневно в течение первых 8 дней. При появлении видимого роста делают мазки, окрашивают их по Граму, и, в соответствии с данными бактериоскопии, делают высевы на среды для определения чувствительности к антибактериальным препаратам и проводят идентификацию выделенных бактерий. При подозрении на анаэробную флору делают параллельные высевы для культивирования в аэробных и анаэробных условиях.

При отсутствии видимого роста на 3, 5, 8 день из всех сред, кроме «двойной среды» и «среды для контроля стерильности», делают высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром и мазки на стеклах, которые окрашивают по Граму. Посевы на чашках инкубируют при 37 град. С в аэробных или анаэробных условиях соответственно предположительному заключению о характере флоры в мазках по Граму. Выращенные бактерии идентифицируют, определяют их свойства, чувствительность к антибактериальным препаратам, фагам и т.п.

При отсутствии роста на 9-10 день дают отрицательный ответ. Однако флаконы с засеянной средой выбрасывать не рекомендуется. Необходимо продолжать держать их в термостате в течение 4-6 недель, проверяя появление роста 2-3 раза в неделю. За это время может быть выявлен замедленный рост персистирующих бактерий, бактерий в L-форме и т.п. При этом, если флаконы закрыты ватно — марлевыми пробками, их нужно запарафинировать смесью воска (1/3) и парафина (2/3) для предотвращения высыхания среды. При отсутствии на средах видимого роста микроорганизмов в первые двое суток следует особенно строго соблюдать правила, обеспечивающие стерильность, т.к. возможность попадания посторонней флоры во время повторных пересевов возрастает с каждым последующим пересевом.

По материалам lektsii.org

Исследования бактерий требуют скрупулезной работы с многочисленным оборудованием и инструментарием. Чтобы микроорганизмы в лабораторных условиях максимально быстро размножались и могли поддерживать нормальную жизнедеятельность, используются специальные среды питательные. Их состав и биофизические условия подходят для активного роста бактериальной культуры.

Колонии бактерий в лабораторных условиях выращиваются на чашках Петри, которые заполнены желеобразным или полужидким содержимым. Это и есть среды питательные, состав и свойства которых максимально приближены к естественным для качественного роста культуры.

Применяются такие среды в микробиологических исследованиях и в медицинских диагностических лабораториях. Последние ведут работу чаще всего с мазками патогенных или условно-патогенных бактерий, систематические положение которых определяются непосредственно в учреждении.

Основное правило работы с бактериями – это правильный подбор питательной среды. Она должна подходить по многочисленным критериям, среди которых содержание микро- и макроэлементов, ферментов, постоянное значение кислотности, осмотического давления и даже процент кислорода в воздухе.

Среды питательные классифицируются на две большие группы:

  1. Естественные среды. Готовятся такие смеси из природных компонентов. Это может быть речная вода, части растений, навоз, овощи, растительные и животные ткани, дрожжи и т. д. Такие среды характеризуются высоким содержанием природных химических веществ, многообразие которых способствует росту культуры бактерий. Несмотря на такие очевидные преимущества, естественные среды не позволяют вести специализированные исследования с конкретными штаммами бактерий.
  2. Синтетические среды. Они отличаются тем, что их химический состав известен в точных соотношениях всех составляющих. Такие среды готовятся для определенной культуры бактерий, метаболизм которой заранее известен исследователю. Собственно, по этой причине возможно приготовить подобную синтетическую среду для развития микроорганизмов. Применяются они для анализа жизнедеятельности бактерий. Например, можно узнать, какие вещества они выделяют в окружающую среду и сколько. На естественных средах микроорганизмы также будут расти, но отслеживать какие-то количественные изменения в составе невозможно из-за незнания изначальных пропорций веществ.

В работе с бактериями могут использоваться не только обычные питательные среды. Микробиология – обширная наука, и поэтому при проведении исследования иногда нужно сделать отбор микроорганизмов по какому-либо признаку. Использование дифференциально-диагностических сред в лаборатории дает возможность отобрать нужные колонии бактерий на чашке Петри по биохимическому признаку их жизнедеятельности.

В состав таких сред всегда входят следующие компоненты:

1. Питательные элементы для роста клеток.

2. Анализируемый субстрат (вещество).

3. Индикатор, который будет давать характерную окраску при протекании определенной реакции.

Примером может служить дифференциально-диагностическая среда питательная «Эндо». Она используется для отбора колоний бактерий, которые могут расщеплять лактозу. Изначально такая среда имеет розоватую окраску. Если колония микроорганизмов не способна расщеплять лактозу, она принимает обычный белый цвет. Если же бактерии могут расщеплять этот субстрат, они окрашиваются в характерный ярко-красный цвет.

В диагностических лабораториях часто ведется работа с мазками, в которых содержится много различных видов бактерий. Очевидно, что для качественной работы необходимо каким-то образом отобрать нужные нам колонии из десятков посторонних. Здесь может помочь питательная среда для бактерий, состав которой идеально подобран для жизнедеятельности только одного вида микроорганизмов.

Например, такая элективная среда пригодна только для размножения кишечной палочки. Тогда из посева множества бактерий на чашке Петри мы увидим только колонии той самой кишечной палочки и никакие больше. Прежде чем приступать к работе, необходимо хорошо знать метаболизм исследуемой бактерии, чтобы удачно ее отобрать из смеси других видов.

Бактерии могут выращиваться не только на твердых субстратах. Среды питательные отличаются между собой по агрегатному состоянию, что зависит от состава при изготовлении. Изначально все они имеют жидкую консистенцию, а при добавлении желатина или агара в определенном процентном соотношении смесь застывает.

Жидкие питательные среды обычно находятся в пробирках. Если появляется необходимость выращивать бактерии в таких условиях, добавляют раствор с пробой культуры и ждут 2-3 суток. Результат может быть различным: выпадает осадок, появляется пленка, плавают мелкие хлопья или образуется мутный раствор.

Плотная питательная среда часто используется в микробиологическом исследовании для изучения свойств колоний бактерий. Такие среды всегда прозрачные или полупрозрачные, чтобы была возможность правильно определить цвет и форму культуры микроорганизмов.

Очень просто готовятся такие субстраты, как мясопептонные смеси на основе бульона, желатина или агара. Если нужно сделать твердый или полужидкий субстрат, в жидкость добавляют соответственно 2-3% или 0,2-0,3% желатина или агара. Они играют главную роль в затвердевании смеси, но никак не являются источником питательных веществ. Таким образом, и получают среды питательные, которые пригодны для роста бактериальной культуры.

По материалам fb.ru

Стерилизация текучим паром применяется для стерилизации сред, содержащих вещества, разлагающихся при температуре выше 100 о С (аммиачные соли, молоко, желатин, картофель, некоторые углеводы). Стерилизацию проводят в автоклаве при открытом спускном кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха. Флаконы или колбы со средой загружают в камеру неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта их с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. Обработку питательных сред текучим паром проводят по 15 – 30 минут ежедневно в течение 3 дней подряд. При первой стерилизации погибают вегетативные формы микроорганизмов, некоторые споры при этом сохраняются и прорастают в вегетативные особи в процессе хранения питательных сред при комнатной температуре. Последующая стерилизация достаточно надежно обеспечивает стерильность среды.

Прогревание стерилизуемой питательной среды производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу, при температуре 60 – 65 о С в течение 5 дней или при 70 – 80 о С в течение 3 дней.

В промежутках между прогреваниями среды выдерживают при температуре 25 – 37 о С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Следует учитывать, что эффективность тиндализации, как и в ряде случаев стерилизации текучим паром, зависит от того, прорастают ли споры. Поэтому она не достигает цели, если споры находятся в среде, непригодной для роста или содержащей ингибиторы, или если среда в промежутках между нагревами инкубируется при температуре, неблагоприятной для прорастания спор.

Читайте также:  Биохимический анализ крови расшифровка у детей 13 лет норма в таблице

Холодная стерилизация. Основными способами холодной стерилизации являются различные типы фильтрования и облучения. Такой стерилизации подвергают растворы веществ, которые при нагревании разрушаются или существенно изменяют свои свойства. К ним относятся многие витамины, антибиотики, ферменты, сыворотки, лекарственные препараты и др.

Для стерилизации фильтрованием используют фильтры, изготовляемые из материалов с различными физико-химическими свойствами, пропускной и адсорбционной способностями.

В микробиологической практике наиболее широко применяются фильтры мембранные, асбестовые (фильтры Зейца), фарфоровые (фильтры-свечи) и стеклянные различных конструкций.

Область применения фильтров определяется, главным образом, диаметром их пор. О пригодности фильтра для стерилизации судят не только по имеющемуся на нем индексу, но и путем предварительной (контрольной) фильтрации через него суспензии относительно небольших бактерий, например, P.aeruginosa, P.diminuta, S. marcescens.

Мембранные фильтры представляют собой диски различного диаметра и толщиной 0,1 – 0,5 мм, изготовляемые из ацетата целлюлозы и нитроцеллюлозы, ацетилцеллюлозы, полиамида и различающиеся по диаметру пор.

Для стерилизации могут использоваться отечественные фильтры марок МФА-МА. МФА-А с размерами пор от 0,20 до 0,45 мкм. Известная фирма «Миллипор» (Франция) выпускает фильтры с диаметром пор от 0,01 до 14,0 мкм; фирма «Синпор» (Чехословакия) –– от 0,02 до 1,0 мкм.

Мембранные фильтры с диаметром пор 0,1 мкм и меньше называются ультрафильтрами и используются для выделения вирусов и высокомолекулярных белков.

К достоинствам мембранных фильтров относится сравнительно высокая скорость фильтрования и малая адсорбционная способность (способность задерживать кроме клеток различные вещества), а основным недостатком –– непригодность для длительного фильтрования, т.к. сравнительно быстро закупориваются поры. Так, при диаметре фильтра 35 мм возможно простерилизовать в среднем 10 мл раствора. Мембранные фильтры используют однократно.

Асбестовые фильтры известны под названием фильтров Зейца. Их изготавливают из смеси асбеста с целлюлозой в виде плотных пластинок различной толщины (от 4 до 6 мм) и диаметра (от 35 до 140 мм). Размер пор от 0,8 до 1,8 мкм.

Плотность фильтров обозначается индексами, указанными на фильтрах (табл.5).

Асбестовые фильтры дешевы, доступны, характеризуются высокой емкостью поглощения. Однако следует учитывать, что в процессе фильтрования из этих фильтров в фильтрат могут выделяться щелочи, соли щелочных металлов, а иногда и соли железа, они способны адсорбировать различные вещества из фильтруемой жидкости.

Асбестовые фильтры, как и мембранные, используются однократно.

Стеклянные фильтры представляют собой двуслойные диски из мелкопористого стекла, впаянные в стеклянные воронки-держатели разной формы. Особенно широко известны фильтры Нутча и Бюхнера.

Наибольший размер пор у стеклянных фильтров –– 200 – 400 мкм, наименьший –– 1 – 1,5 мкм. Для стерилизации используются фильтры с диаметром пор, не превышающим 1 – 1,5 мкм.

В отличие от асбестовых, они обладают меньшей адсорбционной способностью, не загрязняют фильтрат.

Из-за нестандартности размеров пор фильтры из стекла перед употреблением должны быть проверены на стерилизующий эффект, а перед повторным использованием необходима их специальная и весьма длительная обработка.

Фарфоровые фильтры, известные как свечи Шамберлана, Беркефельда, изготавливают из фарфора, кремнезема, каолина с примесью песка и с порами разного размера, и обозначаемые марками L1, L2 ……L13 (чем крупнее поры, тем меньше индекс). Для бактериологических целей, как правило, используют свечи марок L5-L7.

Основные недостатки свечей –– непрочность, низкая скорость фильтрации, быстрая закупорка пор и сложность (или невозможность) регенерации. К тому же механизмом их фильтрующего действия является адсорбция.

Стерилизацию питательных сред или растворов отдельных их компонентов проводят под вакуумом, который создают вакуумным или водоструйным насосом.

Летальное действие на клетки микроорганизмов оказывают многие виды излучений –– ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, α-, β- и γ- лучи радиоактивных элементов и другие.

Чувствительность микроорганизмов к облучению зависит от очень многих факторов –– источника излучений, времени экспозиции, вида микроорганизма, его концентрации и физиологического состояния, состава среды, в которой он находится, и многое другое.

В целях стерилизации используют УФ-облучение с длиной волны 254 нм, однако, его применение ограничено из-за малой проникающей способности. От УФ-лучей микроорганизмы могут быть защищены органическими веществами, пылью, стеклом или другим покрытием, в то время как воздействие на микробные клетки должно быть непосредственным и продолжительным. В силу этого ультрафиолетовые лучи применяют для облучения биологических жидкостей в тонком слое, например, крови, плазмы, вакцин для уничтожения вирусов, но, главным образом, для стерилизации воздуха закрытых помещений, поверхностей, лабораторного оборудования, потолков, стен и полов.

Высокой проникающей способностью и мощностью обладают гамма-лучи, обеспечивающие стерилизующее действие в короткий промежуток времени. Эти лучи проникают через бумагу, дерево, стекло, ряд металлов и другие материалы, вызывая гибель микроорганизмов. Они могут быть использованы для стерилизации жидких и плотных питательных сред, различных биологических жидкостей и растворов. Однако, в связи со специфическими требованиями по технике безопасности работы с источниками этих излучений, а также высокой стоимостью, они используются в практике работы только крупных предприятий.

ГЛАВА 6. БАЗОВЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ (питательные среды общего назначения)
К базовым питательным средам (или средам общего назначения) относятся многие обогащенные и сложные по составу среды, поддерживающие рост микроорганизмов различных систематических групп. Они широко используются почти во всех областях микробиологии (медицинской, почвенной, промышленной, водной и т.д.) для выделения, культивирования, хранения и идентификации микроорганизмов.

Основными питательными компонентами этих сред являются различные продукты, получаемые из мяса крупного и мелкого рогатого скота, казеина, растительных белков.

Наиболее широко используются среды, изготавливаемые на основе мясной воды –– мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА) и их различные модификации. Источником азота в этих средах служат органические соединения мясной воды, продукты расщепления белков –– пептоны, смесь полипептидов, аминокислот.

Мясо-пептонный агар принадлежит к числу наиболее применяемых и длительно используемых питательных сред при работе с микроорганизмами. Эта среда известна более 80 лет и до сих пор остается базовой средой, используемой в клинической микробиологии (причем в разных странах мира) с целью посева, культивирования и последующей идентификации таких микроорганизмов как стафилококки, цепочковые кокки (при условии добавления в среды сыворотки или крови), вся группа кишечных бактерий, палочка сине-зеленого гноя. В англоязычных странах среда известна как Beef EXTRACT AGAR. Среда имеет следующий состав:

Пептон ферментативный 10,0 г

Мясо-пептонный агар содержит (в %, масс): общий азот –– не менее 0,4, аминный азот –– не менее 0,07, сухой остаток –– 4,6, золу –– 1,4.

В то же время существуют различные композиции, включающие в МПА в различных концентрациях кровь, сыворотку крови, яичный желток, селективные факторы, глюкозу, реже другие сахара, что позволяет применять МПА для культивирования различных микроорганизмов (в том числе патогенных), плохо растущих или совсем не растущих на обычных средах.

Основа этой среды, включающая мясную воду, пептон и хлорид натрия используется в качестве самостоятельной среды –– мясо-пептонного бульона (МПБ), имеющего такое же широкое применение в микробиологии.

Пептон ферментативный 10,0 г

В мясо-пептонном бульоне содержится (в %, масс): общий азот –– не менее 0,4, аминный азот аминокислот и низших пептидов –– не менее 0,09, пептоны –– не менее 2,7, сухое вещество –– 3,0 – 3,4, белки –– не более 0,5.

В отечественной практике в качестве аналогов сред МПА и МПБ нашли применение сухие питательные среды: сухой питательный агар (СПА) и ГРМ-агар, получаемые с использованием гидролизата кильки (в случае СПА) или гидролизата рыбной муки (в случае ГРМ-агара).

Вместе с тем, вся технология приготовления «классического» МПА основана на использовании мяса продукта крупного рогатого скота, поэтому СПА и ГРМ-агар, строго говоря, не являются МПА в классическом понимании –– это его более или менее удачные заменители. Однако, очевидно, что с экономической точки зрения питательные среды на основе ГРМ и гидролизата кильки имеют несомненное преимущество. Поэтому «мясной» и «рыбный» варианты МПА не противоречат, а удачно дополняют друг друга.

Многие общеупотребительные питательные среды готовятся на основе ферментативных гидролизатов мяса. Гидролизаты, полученные с помощью пепсина, относятся к пептонам. Так, хорошо известен пептон по Рамону, для приготовления которого используют вареное измельченное мясо (отход при производстве мясной воды) и свиные желудки.

Другим известным пептическим переваром является пептон Мартена, получаемый при гидролизе свиных желудков в кислых условиях и применяемый для культивирования самых различных микроорганизмов (в том числе патогенных). На его основе готовят бульон и агар Мартена, имеющие следующий состав:

Натрий уксуснокислый 5,0 г

При добавлении в бульон Мартена агара в количестве 25 г на литр, получается агар Мартена.

Панкреатические гидролизаты мяса по Хоттингеру встречаются также под названиями панкреатический перевар мяса, триптический перевар мяса, триптон и используются для приготовления бульона и агара Хоттингера. По сравнению с мясо-пептонным бульоном, в который вводят обычно нестандартный компонент пептон, состав гидролизата мяса более постоянен, а по содержанию пептонов более однороден. Бульон Хоттингера имеет следующий состав.

Гидролизат мяса, разведенный дистиллированной водой до 1 литра

с содержанием общего азота 250 – 300 мг%

и аминного азота 30 – 130 мг%.

Натрия дигидрофосфат 0,3 г

Для приготовления агара Хоттингера к смеси компонентов для получения бульона Хоттингера добавляют агар-агар в количестве 1,5 – 2,0%, рН 7,4 – 7,6.

Ферментативный гидролизат мяса выпускают в сухом виде. Энзиматический перевар мяса (перевар Хоттингера) встречается в каталогах фирм под названием Myosate, Proteosopeptone и др., а панкреатический гидролизат, полученный из мышц сердца, под названием bio-Myotone и др.

Кроме мяса и его производных в производстве питательных сред широко используется казеин и продукты его гидролиза (как ферментативного, так и кислотного), которые являются одним из полноценных видов сырья и содержат все основные аминокислоты и витамины, в том числе и те, которые отсутствуют в мясе и продуктах его переработки.

Так, из панкреатического гидролизата казеина готовят казеиновый бульон и агар с глюкозой, имеющий следующий состав (дано на литр):

Панкреатический гидролизат казеина 15,0 г

Содержание в бульоне аминного азота –– 80 – 100 мг%, хлоридов –– 0,5 – 0,6%.

Казеиновый агар имеет такой же состав, как и бульон, но содержит 1 – 2% агара.

В качестве основ для приготовления питательных сред используют растительные виды сырья. Особенно широкое применение для приготовления питательных сред за рубежом получили среды, приготовленные на основе продуктов гидролиза сои, поскольку при гидролизе сои образуются аминокислоты, сходные по составу с аминокислотами животных белков.

Так, для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (а также некоторых грибов) в мировой практике широко используется триптиказо-соевый бульон, имеющий следующий состав (дано на литр).

Панкреатический перевар казеина 17,0 г

Папаиновый гидролизат соевой муки 3,0 г

Кроме классического варианта триптиказо-соевого бульона существует множество его модификаций. Например, триптиказо-соевый бульон с лошадиной сывороткой в количестве 100 мл на литр.

Триптиказо-соевый бульон с кровью человека в количестве 5,0 мл на литр среды.

Для культивирования и хранения Bacillus megaterium используется триптиказо-соевый бульон с неомицином (дано на литр).

Панкреатический перевар казеина 17,0 г

Папаиновый гидролизат соевой муки 3,0 г

Раствор неомицина (на 10,0 мл):

В клинической практике триптиказо-соевый бульон рекомендован некоторыми авторами для выделения микроорганизмов из крови. В этом случае перед стерилизацией бульона в него добавляют антикоагулянт –– натрия цитрат.

Триптиказо-соевый агар, содержащий 2 вида пептона, обеспечивает рост широкого круга микроорганизмов –– аэробов и анаэробов (последних в случае инкубации в анаэробных условиях). Состав среды (на литр).

Панкреатический перевар казеина 15,0 г

Гидролизат соевой муки 5,0 г

Эта среда может быть также использована как основа для агара с кровью (с добавлением 7% стерильной крови) и «шоколадного» агара. Существует большое число вариантов этой среды с добавлением углеводов, крови, сыворотки, секлективных веществ.

ГЛАВА 7 . ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДЫ
Сохранение жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева является важной и, зачастую, сложной задачей. Проблема является актуальной для всех микробиологических служб мира и отечественная не является исключением, поскольку в большинстве случаев время от момента взятия материала до начала исследования лимитировано. Так, по требованиям Американской ассоциации микробиологов, образцы для исследования должны быть переданы на посев не позднее, чем через 2 часа после забора. Если посев невозможен, то срок транспортировки и хранения в зависимости от вида материала и вероятного микроба при соблюдении определенных условий могут быть увеличены, но не более, чем до суток. Одним из приемов, содействующих сохранению микрофлоры, причем не только при отсрочке посева, но и сразу же при взятии биоматериала, является применение специальных транспортных систем, содержащих транспортные питательные среды.

Читайте также:  Вакуумные пробирки для исследования сыворотки с активатором свертывания крови

Использование для транспортировки многих образцов биоматериала (гной, кишечное содержимое и т.п.) обычных питательных сред является, зачастую, серьезной ошибкой, поскольку в них идет быстрое размножение менее требовательных сапрофитных микроорганизмов. Физиологический раствор, который часто применяют для этой цели, не обеспечивает поддержания стабильных уровней редокс–потенциала и рН, а это, в свою очередь, существенно ограничивает жизнеспособность многих патогенных бактерий.

В настоящее время в клинике в качестве транспортных сред (консервантов) используются различные по составу композиции с разной степенью питательной ценности. Использование той или иной их них определяется соответствующими инструкциями, методическими рекомендациями и указаниями, в том числе утвержденными Минздравом РФ.

Это могут быть буферные растворы, содержащие только минеральные соли –– изотонический раствор хлорида натрия или фосфатно-буферный раствор, а также консерванты, содержащие органические вещества –– буферно-глицериновый солевой раствор, глицериновый консервант, 0,15%-ная пептонная вода, буферно-казеиново-дрожжевая среда.

Состав этих композиций следующий:

Калия дигидрофосфат 0,45 г

Динатрия гидрофосфат 5.34 г

Вода дистиллированная 1000 мл

Буферный глицерино-солевой раствор

Глицерин нейтральный 300 мл

Вода дистиллированная 700 мл

Натрия хлорид 0,85% раствор 1000 мл

Глицерин нейтральный 500 мл

Динатрия гидрофосфат 20% раствор 150 мл

Вода дистиллированная 100 мл

Пептон бактериологический 0,1 г

Экстракт пекарских дрожжей 5,0 мл

Фосфатно-буферный раствор до 1000 мл

Так для транспортировки энтеробактерий в качестве консервантов рекомендуется использовать физиологический раствор, глицериновый и фосфатно-буферный растворы. Инструкция по лабораторной диагностике кампилобактериоза предусматривает использование для этих целей, кроме физиологического раствора, 0,1%-ную пептонную воду (от 3 до 48 ч.) или тиогликолевую среду для контроля стерильности (до 3 суток).

Следует отметить, что охлаждение до 4 о С позволяет значительно удлинить сроки транспортировки образцов на этих средах: в физиологическом растворе –– до 24 часов, в 0,1% пептонной воде –– до 72 часов и на тиогликолевой среде для контроля стерильности –– до 5 – 7 суток. При исследовании материала на наличие иерсиний глицериновые консерванты не пригодны. В этом случае исследуемый материал хранят при 4 – 8 о С 7 – 15 дней в фосфатно-буферном растворе или буферно-казеиново-дрожжевой среде.

Известно несколько десятков сред, которые потенциально могут быть использованы как транспортные. Однако большинство из них не отвечают одному из двух обязательных требований, которые и определяют пригодность среды именно как транспортной. Транспортная среда, с одной стороны, должна обеспечивать сохранение жизнеспособности микроорганизма, причем не менее 8 – 12 часов при комнатной температуре, и, в то же время, обязана предупредить или в значительной степени лимитировать размножение микроорганизмов.

Последнее особенно важно. Необходимо сохранить жизнеспособность той части патогенной микрофлоры, которая вне хозяина быстро гибнет, особенно при условии конкурентного роста менее требовательных микроорганизмов. Как уже отмечено, эта ситуация встречается очень часто, если исследуется раневое отделяемое, кишечное содержимое, мокрота, мазки из зева и некоторые другие биосубстраты. Облигатно анаэробные бактерии, пневмококки, гемофильные бактерии, нейссерии и многие другие микроорганизмы трудно выделить из биоматериала, если параллельно идет процесс интенсивного размножения сапрофитных бактерий или более жизнестойких болезнетворных микроорганизмов. Кроме того, гибель требовательных бактерий определяется созданием неблагоприятных для них условий, таких как неблагоприятные рН, окислительно-восстановительный потенциал, наличие или отсутствие свободного кислорода, а также действие антимикробных метаболитов, которые при определенных условиях могут образовывать актиномецеты, псевдомонады, эшерихии и другие содержащиеся в образце микроорганизмы.

Опыт создания и использования транспортных питательных сред велик и формально велика их номенклатура. Однако фактически в мировой практике стабильно используют только две транспортные среды, которые именуют по фамилиям их создателей: среда Эймса и среда Кери-Блейра, и которые являются наиболее универсальными транспортными средами для сохранения подавляющего большинства видов бактерий. Среда Эймса предназначена для широкого круга бактерий, среда Кери-Блейра для кишечных микроорганизмов.

Среда Кери-Блейра была предложена разработчикам в 1954 году. За прошедший длительный период ее рецептура фактически не менялась. Не вызывало разночтений и назначение среды –– изначально оно трактовалось как сохранение микроорганизмов при транспортировании с акцентом на микроорганизмы кишечника.

Динатрия гидрофосфат 1,1 г

Вода дистиллированная до 1000 мл

Микроорганизмы кишечника многообразны, они включают представителей резидентной и транзиторной микрофлоры. Последняя в свою очередь может включать самые разнообразные бактерии и грибы, в т.ч. сапрофитные. В то же время, практика микробиологических служб клинических учреждений нацелена на выделение определенного круга микроорганизмов кишчника, прежде всего представителей семейства энтеробактерий (шигеллы, сальмонеллы), реже т.н. неферментирующих грамотрицательных бактерий, кишечных кокков и дрожжеподобных грибов.

Транспортная среда Кери-Блейра предупреждает гибель микробных клеток, сохраняет их жизнеспособность, но при этом препятствует размножению. Эти свойства среды обеспечиваются ее компонентным составом. Низкая питательная ценность и, прежде всего, отсутствие источников азота и углерода, как ключевых элементов развития популяции, ограничивает процессы роста и размножения микроорганизмов.

Процедура использования этой среды заключается в следующем: расплавленную среду Кери-Блейра разливают в стерильные пробирки по 6 – 9 мл. Объем среды в пробирках определяется техникой посева. При посеве мазка, взятого тампоном на тампонодержателе, достаточен небольшой столбик среды –– 6 мл. При прямом посеве биоматериала (без тампона) объем среды в пробирке увеличивают. В таком виде среду можно длительно хранить при температуре 2 – 8 о С.

Биологический материал погружают в столбик среды таким образом, чтобы он не оставался на ее поверхности. После этого пробирку с засеянной средой помещают в контейнер и направляют в лабораторию.

Среда Кери-Блейра сохраняет жизнеспособность требовательных бактерий около суток, после чего отмечают постепенную гибель клеток. Поэтому пересев с транспортной среды на обогащенные, дифференциально-диагностические или иные питательные среды необходимо проводить в максимально доступные сроки. Вместе с тем, есть данные о том, что сальмонеллы в этой среде сохраняют жизнеспособность несколько месяцев.

Среда Эймса используется как транспортная для широкого круга микроорганизмов самых разнообразных биологических субстратов (гной, раневое отделяемое, мокрота, СМЖ и др.), кроме кала. Среда Эймса может быть с углем и без него:

Динатрия гидрофосфат 1,05 г

(как необязательный компонент) 10,0 г

Вода дистиллированная до 1000 мл

Уголь добавляют в среду Эймса для сорбции микробных метаболитов, негативно влияющих на высокочувствительные патогенные микроорганизмы. В частности, это условие особенно важно для сохранения жизнеспособности гонококков.

Техника посева на среду Эймса такая же, как и на среду Кери-Блейра.

Противоречиво мнение о пригодности среды Эймса для транспортировки биосубстратов с облигатно-анаэробными бактериями. Безусловно, наличие низкого редокс-потенциала, который обеспечивается тиогликолятом натрия, а также столбик полужидкого агара, в который погружается биоматериал, ограничивают контакт микроорганизмов с атмосферным кислородом и поступление его в среду в растворенном виде, что может способствовать сохранению жизнеспособности ряда видов облигатно-анаэробных бактерий (наиболее демонстративны в этом отношении клостридии). Однако среда не обеспечит длительного сохранения тех облигатных анаэробов, которые высоко чувствительны к кислороду (например, некоторых видов бактероидов).

Кроме отмеченных выше, имеется широкий перечень транспортных сред, применяемых для транспортирования определенных видов микроорганизмов. Наиболее строгие требования предъявляются к транспортированию материала, подлежащего бактериологическому исследованию на наличие неспорообразующих анаэробных микроорганизмов. Эти бактерии быстро погибают при контакте с кислородом воздуха, что заставляет использовать для транспортирования материала сосуды, заполненные инертным газом. Так, например, хорошо известна жидкая обогащенная среда под инертным газом с гемином и витамином К для прямого посева крови и жидких биосубстратов. Она служит одновременно транспортной средой и средой для культивирования анаэробных бактерий, включая строгих анаэробов

Ряд целевых транспортных сред включает в себя антимикробные агенты (селективный компонент). Эти вещества подавляют рост сопутствующей микрофлоры, но не действуют на искомый микроб. Остальные компоненты среды обеспечивают его жизнеспособность. Примером может служить среда для листерий, которая одновременно является «голодной» и содержит вещества селективного действия (дано на литр):

Натрия глицерофосфат 10,0 г

Налидиксовая кислота 0,04 г

Значительно более «богатой» представляется среда для транспортирования кампилобактерий (т.н. Кампи ТХИО среда), состав которой включает пять антимикробных препаратов (дано на литр):

Панкреатический перевар казеина 20,0 г

Натрий сернистокислый 0,2 г

Приведенная пропись мало чем отличается от состава других питательных сред для кампилобактерий (см.заключительную главу). Очевидно, что разработчики среды сделали акцент, в первую очередь, на селекционирующем действии антибиотиков, сохранив, в целом, состав среды, достаточный для поддержания жизнеспособности многих микроорганизмов.

Такой же принцип использован в транспортной среде для хламидий. Кроме того, в ней учтена возможность применения для селекции осмотического фактора (дано на литр).

Антибиотики и сыворотку асептично вводят в стерильную питательную среду перед ее разлитием во флаконы и пробирки.

Существует ряд достаточно сложных по составу транспортных питательных сред для нейссерий, микоплазм и их сочетаний преимущественно в биосубстратах, полученных из мочеполового тракта. Некоторые варианты рассматриваются как транспортные среды для требовательных бактерий в целом, но особенно для нейссерий. Пропись одной из них, принадлежащей к большой группе т.н. Transgrow Medium, приведена далее (дано на литр).

Панкреатический перевар казеина 7,5 г

П-Аминобензойная кислота 0,0002 г

Антибиотическая добавка 10,0 мл

Антибиотическая добавка включает ряд антибиотиков, призванных придать среде селективные свойства. Имеется ряд предложений, ни одно из которых в полной мере, естественно, не может обеспечить гарантированное подавление роста сопутствующих микроорганизмов. В разных источниках наиболее часто упоминают следующий состав (на литр среды добавляют 10 мл раствора антибиотиков).

В заключение следует еще раз подчеркнуть, что несмотря на большое число предложенных прописей транспортных сред, в микробиологической (медицинской) литературе наиболее часто упоминают среды Эймса и Кери-Блейра. Ряд авторов считает приемлемой среду Стюарта, которая, фактически, является предшественницей двух других. Среда Эймса большинству авторов представляется предпочтительней, чем среда Стюарта.

ГЛАВА 8. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
Среди возбудителей заболеваний человека энтеробактерии относятся к числу относительно нетребовательных микроорганизмов. Они способны давать рост на различных базовых питательных средах, используемых в микробиологических исследованиях. Однако семейство Enterobacteriaceae достаточно обширно; оно объединяет разные по своим свойствам бактерии. Кроме того, те области человеческого тела, где многие представители семейства являются объектом естественного обитания или паразитирования, обильно населены резидентной микрофлорой. Вот почему питательные среды, используемые при работе с энтеробактериями, в первую очередь решают задачу их селективного выделения и бактериологической диагностики. Это характерно как для отечественной, так и зарубежной практики.

Согласно многим отечественным методическим рекомендациям и указаниям, в том числе одобренных Минздравом, как обязательные при бакдиагностике энтеробактерий предложено использовать среды обогащения, среды для селективного выделения и дифференциации. Их перечень приведен в таблице. Названы те среды, которые освоены отечественными производителями, а также те из них, чье внедрение в микробиологическую практику признано перспективным.

Отечественные рекомендации в принципиальном плане мало отличаются от каждодневной практики применения питательных сред за рубежом. Питательные среды для энтеробактерий сконструированы таким образом, чтобы использовать ростовые особенности отдельных родов и видов и их способность конвертировать тот или иной субстрат. В следующей таблице 7 выборочно обобщены те свойства энтеробактерий, которые учтены и успешно реализованы в питательных средах для дифференциации микроорганизмов этого семейства.

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (1990 г.) в бактериологических лабораториях для работы с энтеробактериями рекомендованы следующие питательные среды:

транспортные среды –– Эймса, или Кери-Блейра, или Стюарта;

базовые среды – кровяной агар, агар на переваре сои (tryptic soy agar);

селективные и дифференциально-диагностические среды –– ацетатный агар, пептонная вода с реактивом Андреде, среда Клиглера, агар МакКонки, жидкая среда для определения уреазы и образования индола, среда с дезоксихолатом и цитратом, SS-агар (как альтернатива среды с дезоксихолатом), цитратный агар Симмонса. К этой же группе питательных сред может быть отнесен названный в перечне brolacin agar, более известный в России, как CLED-агар, выпускаемый НПО «Питательные среды», г.Махачкала (среда, содержащая цистин, лактозу и индикатор и дозированная по электролитному составу). Хотя, строго говоря, эта среда предназначена для выделения не только энтеробактерий.

Заслуживает упоминания еще один зарубежный опыт.

В практике работы микробиологов США при выделении энтеробактерий из кишечного содержимого предложено использовать следующие группы питательных сред.

  1. Как транспортную –– среду Кери-Блейра.
  2. Дифференциально-диагностические: агар МакКонки и ЕМВ-агар (с эозином и метиленовым голубым).
  3. Умеренно селективные: гектоен-энтеро агар, SS-агар (шигелла-сальмонелла агар), XLD-агар (с ксилозой, лизином и дезоксихолатом).
  4. Высоко-селективные среды: агар с бриллиантовым зеленым и висмут-сульфит агар.

Естественно, что все перечисленное не исключает применения базовых питательных сред, прежде всего питательного агара с добавлением бараньих эритроцитов.

Назначение транспортной среды очевидно. Вторая группа сред позволяет отдифференцировать культуры, ферментирующие лактозу, от лактозонегативных. Следующая (умеренно селективная среда) обеспечивает рост сальмонелл и шигелл, в то время как рост других энтеробактерий частично или полностью подавляется. Последняя группа предназначена для выделения сальмонелл, но рост шигелл на них не гарантирован.

По материалам ekollog.ru

Добавить комментарий